СПОСОБЫ ОЦЕНКИ INVITRO РАЗДРАЖАЮЩЕГО КОЖУ ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ

С развитием фармации, производства косметических веществ, промышленности и агрохимии,остро встает вопрос изучения возможных негативных эффектов новых веществ, с целью повышения безопасности и качества жизни общества. Одним из таких негативных воздействий может являться раздражающий кожу эффект. Определить потенциал раздражения кожи – неотъемлемая часть комплексной программы токсикологии для новых химических веществ и продуктов питания.

В настоящее время окончательная доклиническая оценка безопасности химических веществ в значительной степени основана на экспериментах с животными. В пример можно привести наиболее распространенный тест Дрэйза[1]. Однако этические проблемы, связанные с использованием лабораторных животных, валидностью кожи животных как кожи человека, а также поиск более эффективных, в том числе и с экономической точки зрения, методов оценки раздражения  кожи – способствуют поиску и изучению альтернативных способов.

Первым и наиболее важным вопросом стоит валидация альтернативных методов, т.е. установление надежности метода для конкретной цели. Для этого исследователю должны быть известны:

  1. Принцип и механизм действия метода;
  2. Воспроизводимостьполученных данных;
  3. Полученные данные должны эффективно использоваться, для предсказания токсичности вещества, чтобы можно было адекватно оценить уровень его безопасности.

Как только валидность метода доказана, необходима проверка его релевантности, т.е. значимости метода в решении определенной задачи. Это достигается путем соответствия метода следующим критериям:

  1. Полученные данные должны легко встраиваться в существующий научно-информационный базис;
  2. Необходимо подтверждение практической значимости полученного метода.

На данный момент существует несколько организаций международного уровня, целью которых является создание и продвижение новых методических руководств, в том числе, и по оценке токсического воздействия новых веществ. Такие как OCED (OrganisationforEconomicCo-operationandDevelopment) [2], а также Европейский центр по валидации альтернативных методов и координационный комитет по статистике альтернативных методов [3] – которые были созданы в США и Европе.

Одним из решений для сложившихся задач, является освоение и модификация методов invitro. Так, например, для оценки токсического действия неизвестного агента на кожу используют методы клеточных культур, ремоделированный эпидермис человека, либо непосредственное тестирование кожных дисков гуманно умерщвленных животных. Далее будет краткий обзор каждого метода.

Культуры клеток.  Главным преимуществом данного метода является получение количественного показателя, который позволяет сравнить или предсказать воздействие тестируемых веществ. На начальных этапах проходит тестирование веществ на перевиваемой клеточной линии кератиноцитов человека (HaCAT), а для более детального анализа могут использоваться культуры первичных клеток, например, фибробластов человека. К недостаткам данного метода можно отнести получение интегрального показателя IC50 (полуингибирующая метаболическую активность клеток доза – для МТТ-теста; NR50 – доза, вызывающая половинное ингибирование поглощения клетками витального красителя – для NRU-теста). Однако, также могут использоваться и другие показатели. Например, активность фермента лактатдегидрогеназы в культуральной среде, который в норме не выходит за компартмент клетки – может показать степень повреждения клеточной мембраны; а анализ высвобождаемых клетками цитокинов воспаления также может дать представление о развитии, собственно, воспалительного процесса [4,5,6].

Рисунок 1 – Сравнительное тестирование химически синтезированных детергентов, с используемым на рынке лаурилсульфатом на кератиноцитах человека (HaCAT).
Рисунок 1 – Сравнительное тестирование химически синтезированных детергентов, с используемым на рынке лаурилсульфатом на кератиноцитах человека (HaCAT).

N-индекс показывает во сколько раз величина (IC50,NR50) выше таковой у модельного вещества [5].

Ремоделированный эпидермис  человека. Эта модель эпидермиса человека представляет собой многослойную кожу человека, выращенную в лаборатории. Ее можно использовать для проверки раздражения кожи. Существуют коммерческие наборы под торговыми наименованиями, такими как SkinSquaredTM и EpiskinTM. Данный тест использует денатурацию белка и изменения в конформации других макромолекул в качестве конечной точки, на которой оценивается токсический потенциал соединения. Анализ лучше всего описывается как двухкамерная физико-химическая модель. Первый отсек состоит из барьерной мембраны, состоящей из матрицы кератина/коллагена, к которой прикреплены красные индикаторы. Интересующее соединение расположено непосредственно на поверхности этой мембраны. Последовательные взаимодействия между соединением и белково-водным материалом приводят к вариабельной денатурации, что приводит к высвобождению индикаторного красителя. Затем соединение диффундирует через мембрану и входит во вторую группу. Это отделение описано как макромолекулярная матрица, которая состоит из коллагена, гликозаминогликанов, свободных жирных кислот, аминокислот, фосфолипидов и буферных солей. Поскольку эти компоненты присутствуют в высокоупорядоченном расположении, эта водная фаза модели характеризуется полупрозрачностью. Взаимодействия между составом и различными компонентами этой высокоупорядоченной матрицы приводят к дальнейшей ее денатурации, приводя к получению вариаций помутнения. Конечным результатом взаимодействия компонента в двух отсеках является сумма красителя, высвобождаемого из первого отделения, и мутность, возникающая во втором отсеке. Оба этих параметра измеряются вместе спектрофотометрически [7].

Рисунок 2 – Упрощенная схема коммерческого набора Episkin[7].
Рисунок 2 – Упрощенная схема коммерческого набора Episkin[7].
Тест на чрескожноеэлектросопротивление

(reduction in the inherent transcutaneous electrical resistance TER). Этот тест оценивает потенциал коррозионной активности на диске кожи испытуемого материала.  Такие диски получены от гуманно убитых молодых крыс. Коррозионные вещества необратимо нарушают целостность и функциональность нормального рогового слоя. Это измеряется как уменьшение избыточного чрескожного электросопротивления ниже уровня контрастного порога. Это рекомендуемый регламентированный скрининг-тест. Коррозионные материалы идентифицируются по способности уменьшать нормальную целостность оболочки и барьерной функции, измеряемой как уменьшение врожденного сопротивления. Некоррозийные вещества не уменьшают электросопротивление ниже порогового уровня. Тест показал, что он может быть применен для тестирования разнообразной группы химических веществ, с различными физическими формами, включая органические кислоты, органические основания, нейтральные органические соединения, неорганические кислоты, неорганические основания, неорганические соли, электрофилы, фенолы и мыла/поверхностноактивные вещества [8]. Тест на крысиную кожу научно обоснован для использования в качестве замены теста на животных. С 2004 года он появился в Руководстве OECD как номер 430 [9].

Список использованных источников:

  1. Calvin G. New approaches to the assessment of eye and skin irritation //Toxicology letters. – 1992. – Т. 64. – С. 157-164.
  2. Organisation for Economic Co-operation and Development [Электронныйресурс] // URL: http://www.oecd.org (датаобращения: 10.09.2017)
  3. The European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing [Электронныйресурс] // URL: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu (датаобращения: 10.09.2017)
  4. Robinson M. K., Osborne R., Perkins M. A. In vitro and human testing strategies for skin irritation //Annals of the New York Academy of Sciences. – 2000. – Т. 919. – №. 1. – С. 192-204.
  5. Sanchez L. et al. Potential irritation of lysine derivative surfactants by hemolysis and HaCaT cell viability //Toxicology letters. – 2006. – Т. 161. – №. 1. – С. 53-60.
  6. Corsini E. et al. Endogenous interleukin-1α is associated with skin irritation induced by tributyltin //Toxicology and applied pharmacology. – 1996. – Т. 138. – №. 2. – С. 268-274.
  7. Flamand N. et al. Development of genotoxicity test procedures with Episkin®, a reconstructed human skin model: Towards new tools for in vitro risk assessment of dermally applied compounds? //Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. – 2006. – Т. 606. – №. 1. – С. 39-51.
  8. Oliver G. J. A., Pemberton M. A., Rhodes C. An in vitro skin corrosivity test—modifications and validation //Food and Chemical Toxicology. – 1986. – Т. 24. – №. 6-7. – С. 507-512.
  9. OECD (2015), Test No. 430: In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test Method (TER), OECD Publishing, Paris. [Электронный ресурс] // URL: http://dx.doi.org/10.1787/9789264242739-en (дата обращения: 10.09.2017)

© Матвей Матвеенков, лаборант лаборатории комбинированных воздействий